細胞液氮容器存(cún)儲時間過長會(huì)導致細胞活(huó)性(xìng)顯(xiǎn)著(zhù)下(xià)降(jiàng)，這一現(xiàn)象在(zài)細(xì)胞(bāo)保(bǎo)存(cún)與(yǔ)運(yùn)輸(shū)中廣(guǎng)泛存在。細(xì)胞在(zài)液(yè)氮(dàn)環境下(xià)能夠長時間(jiān)保(bǎo)持較低的(dí)溫度，減(jiǎn)緩代(dài)謝過程，理(lǐ)論(lùn)上(shàng)能(néng)夠保存(cún)其生(shēng)物活(huó)性。但如果存儲(chǔ)時(shí)間(jiān)過(guò)長(cháng)，液氮容(róng)器(qì)內的(dí)溫(wēn)度(dù)波動(dòng)，冷(lěng)凍過程的(dí)損傷以及(jí)細(xì)胞自我修(xiū)復(fù)能力(lì)的減弱都會影響(xiǎng)其(qí)存(cún)活率和功(gōng)能(néng)恢復(fù)能力(lì)。實(shí)驗(yàn)表明(míng)，細胞在液氮(dàn)中(zhōng)長期存儲超過一定(dìng)期限(xiàn)後，活性(xìng)逐步(bù)下降，影響其(qí)後(hòu)續的培養(yǎng)和應用。

　　影響(xiǎng)細(xì)胞活(huó)性(xìng)的因素

　　液氮存儲(chǔ)溫度通(tōng)常維(wéi)持在(zài)-196°C，這一(yī)低(dī)溫狀(zhuàng)態(tài)下細(xì)胞代(dài)謝(xiè)幾(jī)乎停滯(zhì)，細胞(bāo)膜(mó)和(hé)內(nèi)部(bù)結(jié)構得以保(bǎo)存。然(rán)而(ér)，細胞液氮存儲過久，尤(yóu)其(qí)是超出(chū)6個(gè)月(yuè)的保(bǎo)存期時，會出現(xiàn)明(míng)顯的活性(xìng)下降(jiàng)。研究(jiū)表(biǎo)明(míng)，細胞在液(yè)氮中的(dí)存儲(chǔ)時(shí)間超(chāo)過1年後，其復蘇(sū)後的增(zēng)殖能(néng)力(lì)會顯著(zhù)下(xià)降，具(jù)體表現為細(xì)胞(bāo)的增殖指數(shù)減少20%-40%，這一現象在不同種(zhǒng)類(lèi)的細胞(bāo)中有所(suǒ)不(bù)同(tóng)。

　　對於(yú)一些細(xì)胞類型(xíng)，比如人類胚胎(tāi)幹細胞(bāo)或誘導(dǎo)多能幹細胞(bāo)(iPSCs)，存儲超過兩年(nián)的細胞(bāo)通常(cháng)顯(xiǎn)示(shì)出(chū)較(jiào)差(chà)的(dí)活性和(hé)功(gōng)能恢復率。常(cháng)規(guī)體(tǐ)外(wài)培養(yǎng)的(dí)細胞(bāo)，如人(rén)類(lèi)成(chéng)纖維細胞(bāo)(HDFs)和鼠(shǔ)胚胎成纖(xiān)維細胞(bāo)(MEFs)也會(huì)在(zài)存(cún)儲(chǔ)超過12個(gè)月後(hòu)，展現(xiàn)出(chū)更高的死(sǐ)亡(wáng)率(shuài)和(hé)低(dī)效(xiào)的分(fēn)裂能力(lì)。基因組(zǔ)穩(wěn)定性(xìng)和膜結(jié)構損(sǔn)傷(shāng)也是長期(qī)存儲的一(yī)個(gè)重要問題，細胞(bāo)的(dí)DNA損(sǔn)傷(shāng)和修復(fù)機製會在(zài)長(cháng)期(qī)冷凍(dòng)狀(zhuàng)態(tài)下逐(zhú)步喪(sāng)失(shī)，這(zhè)使得(dé)細胞(bāo)復(fù)蘇後(hòu)的功能受(shòu)損。

　　溫(wēn)度波(bō)動對細(xì)胞存(cún)儲(chǔ)的(dí)影響(xiǎng)

　　液(yè)氮(dàn)容器的溫(wēn)度(dù)保持穩(wěn)定(dìng)性對細(xì)胞活(huó)性至關(guān)重(zhòng)要(yào)。研究表明(míng)，溫度(dù)波動(dòng)是(shì)導(dǎo)致細胞(bāo)在存(cún)儲過程(chéng)中損傷的(dí)一個(gè)重要因素。雖然液氮(dàn)本身具(jù)有低的(dí)溫度，但容器的管理和操作(zuò)不當可能導致(zhì)內部(bù)溫度的波(bō)動(dòng)，從而影(yǐng)響(xiǎng)細(xì)胞(bāo)的生物學特(tè)性。液氮(dàn)存(cún)儲(chǔ)箱內(nèi)溫度的波動通常會導致(zhì)冰晶的形成和(hé)細胞膜(mó)的破裂，這對於存(cún)儲超過(guò)一(yī)年的(dí)細胞來說，影響更為顯著。

　　液(yè)氮容器(qì)中的溫(wēn)度(dù)波動通(tōng)常(cháng)發生(shēng)在開(kāi)蓋或運輸過(guò)程中(zhōng)。例如(rú)，液氮容器開蓋(gài)時(shí)，溫度可(kě)能短(duǎn)暫上升至(zhì)-150°C以上(shàng)，這一溫度(dù)的(dí)波動會(huì)導(dǎo)致細胞凍存(cún)狀態(tài)的不穩(wěn)定，尤其是(shì)對於一(yī)些細(xì)胞種類，其耐低溫的能(néng)力較差(chà)。為(wéi)了盡(jìn)量減少這(zhè)種(zhǒng)影響(xiǎng)，科(kē)研人員(yuán)通常建(jiàn)議使用(yòng)冷凍保(bǎo)護(hù)液(yè)，並確(què)保在(zài)操(cāo)作(zuò)過程(chéng)中盡量(liáng)避免(miǎn)頻(pín)繁開蓋。長期存儲時，使用(yòng)保(bǎo)持(chí)穩定溫度(dù)的(dí)液氮(dàn)箱和進行定(dìng)期(qī)監(jiān)控，能夠有(yǒu)效減少溫度(dù)波(bō)動對細胞(bāo)活(huó)性的(dí)負(fù)麵影(yǐng)響。

　　細(xì)胞(bāo)凍(dòng)結與(yǔ)復蘇(sū)過程中(zhōng)的損傷

　　細胞(bāo)凍結與(yǔ)復蘇的過程(chéng)本(běn)身(shēn)也(yě)是(shì)細(xì)胞活性(xìng)下(xià)降的(dí)一個(gè)關鍵(jiàn)因素(sù)。在液(yè)氮中(zhōng)存(cún)儲的細(xì)胞通(tōng)常是通過(guò)冷(lěng)凍(dòng)保護液(yè)(如(rú)DMSO，甘油等)來降低冰(bīng)晶(jīng)的形(xíng)成(chéng)，減(jiǎn)少(shǎo)細胞(bāo)內外(wài)水分的結冰，避免細胞因(yīn)冰晶(jīng)擴展(zhǎn)而(ér)破(pò)裂。然(rán)而(ér)，長時間(jiān)冷凍存(cún)儲會(huì)使得(dé)保護液的效(xiào)果逐漸降低(dī)，冷凍(dòng)過(guò)程(chéng)對細胞(bāo)的損(sǔn)傷會累(léi)積。隨(suí)著存儲時(shí)間的(dí)延(yán)長，復(fù)蘇後(hòu)細(xì)胞的損(sǔn)傷也愈(yù)加(jiā)明顯，特(tè)別是對(duì)於(yú)一些(xiē)細胞，凍(dòng)存液並不(bù)能(néng)完全(quán)防止細胞內液體的冰(bīng)凍。

　　研(yán)究表明，在(zài)經(jīng)過(guò)超過(guò)12個(gè)月的(dí)存儲(chǔ)後(hòu)，細(xì)胞(bāo)復(fù)蘇(sū)後(hòu)的生長速度普遍減(jiǎn)慢，且隨著凍(dòng)存周期的延長，細胞膜(mó)的(dí)完整(zhěng)性會(huì)逐(zhú)步下降(jiàng)，細胞增殖能力逐漸減弱(ruò)。這(zhè)種下降趨勢在(zài)細(xì)胞復(fù)蘇後(hòu)的(dí)1-2周(zhōu)內尤為明顯，特別(bié)是對於低(dī)溫冷凍保(bǎo)存的(dí)免疫(yì)細(xì)胞(bāo)和(hé)腫(zhǒng)瘤(liú)細(xì)胞係，其在液(yè)氮存儲超過18個月後，復(fù)蘇後的(dí)細(xì)胞活性(xìng)損失(shī)達(dá)到(dào)30%-50%。此(cǐ)外，細胞間(jiān)質(zhì)和細胞(bāo)膜的破(pò)壞，會(huì)導(dǎo)致後(hòu)續培(péi)養(yǎng)過程(chéng)中(zhōng)的死亡率上升，進(jìn)一步(bù)影(yǐng)響(xiǎng)實(shí)驗結果(guǒ)。

　　如何減(jiǎn)少長(cháng)期(qī)存儲對(duì)細(xì)胞(bāo)活性的影響

　　為了減(jiǎn)少液氮(dàn)存儲(chǔ)時間(jiān)過長(cháng)對細胞活性的影響，可(kě)以(yǐ)采取以下(xià)幾(jī)個方法來(lái)提(tí)升細(xì)胞存(cún)儲(chǔ)的質量和活性。首先(xiān)，控製液(yè)氮(dàn)容器的溫度波(bō)動，確保(bǎo)冷凍保存(cún)環(huán)境的(dí)穩定(dìng)性。其(qí)次，在細胞復(fù)蘇(sū)後，應(yīng)盡(jìn)快進(jìn)行培養，避免(miǎn)細胞在低溫狀(zhuàng)態(tài)下停留(liú)過(guò)久(jiǔ)。適當(dāng)使(shǐ)用冷凍保(bǎo)護(hù)劑(jì)並確(què)保冷凍過程的規(guī)範(fàn)性，是減少細(xì)胞在(zài)長(cháng)期存儲(chǔ)中(zhōng)損(sǔn)傷(shāng)的重要(yào)手段。

　　另(lìng)外(wài)，定(dìng)期檢(jiǎn)查(chá)存儲條(tiáo)件(jiàn)，監(jiān)控(kòng)液氮存(cún)儲(chǔ)箱的溫度和液位，以(yǐ)及對(duì)細胞冷凍保存(cún)歷史(shǐ)的管(guǎn)理，都(dū)是確(què)保細(xì)胞在長期(qī)存儲(chǔ)後能(néng)夠(gòu)大(dà)程度保(bǎo)持活(huó)性(xìng)的重要(yào)措施。此外，盡(jìn)可(kě)能(néng)在(zài)液(yè)氮中存(cún)儲(chǔ)時間(jiān)不超(chāo)過1年，特(tè)別(bié)是(shì)對於高(gāo)敏(mǐn)感度的細(xì)胞種(zhǒng)類(lèi)，應避免(miǎn)過(guò)長(cháng)時間(jiān)存儲。

　　存儲(chǔ)時間過長的細胞往往(wǎng)會(huì)在復(fù)蘇後表現(xiàn)出(chū)較差的生長和分裂能力。因(yīn)此(cǐ)，在細胞(bāo)的保存(cún)和使(shǐ)用過(guò)程中，考(kǎo)慮存(cún)儲時(shí)間和復蘇(sū)後(hòu)的(dí)實驗設(shè)計是確(què)保(bǎo)實驗(yàn)結果(guǒ)穩定(dìng)性(xìng)的(dí)重(zhòng)要(yào)因素。